定制化液相芯片

• 液相芯片产品针对目标区域合成出特异性探针，通过探针与基因组DNA的液相杂交，实现对目标区域序列的特异性捕获、富集。对捕获到的片段进行高通量测序，可以对候选基因或候选位点进行高深度靶向检测，精准分型。结合参考基因组和表型信息，可实现育种性状的高效富集，优秀单株的精准筛选。
  分子育种中，科学家和育种家们借助简单高效的技术对优秀育种群体进行基因分型，从而进行更为高效、精准的选育。随着二代测序数据的积累，需求逐渐由全面获得群体遗传信息转向精准高效检测靶向位点。不朽情缘自主研发的商业化NGP液相芯片（Novogene Germplasm resource screening panel）紧跟育种4.0时代脚步，作为生物育种前期基因分型的重要工具将为国家粮食安全根基注入新的动能，作出新的贡献。

FAQ

• 1 关于覆盖度与均一度的问题

  • 覆盖度表示测序数据对于目标区域的覆盖情况；均一度表示各位点的实际测序深度偏离平均测序深度的情况， 一般以达到平均测序深度20%的区域占覆盖区域的比例为衡量标准。影响覆盖度和均一度的因素主要包括：
  
  
  • 1)探针设计：设计报告会明确探针覆盖的目标区域（probeCov.bed）及探针未覆盖的目标区域（probeMissed.bed）， 探针覆盖目标区域实际覆盖度一般可以达到99%以上。探针设计方案能够充分考虑客户对于目标区域的个性化需求， 实时改进算法，保证为客户提供高质、高效的Panel。探针设计过程中，会对目标序列进行热力学稳定性评估，并对 热力学稳定性低的区域进行剂量补偿。GC含量会对探针的结合能力以及PCR扩增过程产生较大影响，不朽情缘采用精 细的GC含量分级策略合成探针。通过调整不同GC含量区域的探针比例，对目标区域进行高度均一地覆盖。此外，不朽情缘 致源探针设计方案能够充分考虑重复序列区域的覆盖度，按照序列在基因组中的重复程度分级，独立制备并实时调控 探针浓度，以达到数据覆盖度、均一度与捕获效率的平衡。
  
  
  • 2)样本类型与样本质量：提取得到的gDNA总量应在200ng以上，浓度25ng/μL，主条带完整无明显降解，无蛋白或其 他杂质污染。低质量gDNA（如FFPE样本提取得到的 DNA）及游离DNA通常存在总量不足、降解断裂严重等问题，会影响覆盖度和均一度。
  
  
  • 3)实验室环境及实验流程：实验室应保持洁净，实验室所用仪器设备、耗材、所配试剂应符合PCR实验室标准。实验人 员应严格按照SOP规程完成实验，实验过程中各项质检数据应达到SOP所示要求。样本DNA起始投入量是影响均一度的重 要指标，不朽情缘建议gDNA投入量为200ng，cfDNA投入量为20ng以上。文库构建与杂交捕获中PCR的循环数过多，会因 PCR偏好性带来均一度降低的可能；文库纯化过程中乙醇残留未晾干，会影响文库片段的回收效率，进而影响覆盖度和 均一度；不同质量样本混合杂交同样会对数据指标有一定影响。另外，上机测序过程中，测序仪对于重复序列区域会呈 现出所测碱基质量下降的现象，这会造成分析过程中过滤到较多的数据，这种情况会导致重复序列区域（例如MSI区域） 覆盖深度较低或覆盖不完全。
  
  
  • 4)生物信息分析：分析下机数据时首先应确定所使用的参考基因组及目标区域bed文件是否正确。对于高度同源序列， 受制于二代测序读长较短的原因，所测序列可能无法准确比对到基因组上，导致reads被过滤进而影响覆盖度和均一度。
  
  
  • 5)目标区域序列及目标基因：不朽情缘对于GC含量异常区域及重复序列区域设计均进行了特殊安排并优化了设计方案， 但对于目标基因的这些区域，仍然可能出现覆盖度低、测序深度低等情况。另外，目标区域基因缺失（例如GSTM1基因） 或目标区域基因区分性别（例如：SRY基因）可能会导致个体样本覆盖度降低。目标区域存在插入缺失突变（Indel）、 结构变异（SV）、微卫星不稳定（MSI）位点，同样可能造成捕获reads数减少，测序深度较低。
  
  

• 2 关于捕获效率

  • 1)在液相探针杂交捕获测序中，捕获效率用来描述探针杂交的特异性，是指落在目标区域的序列占比对到基因组上的序列 的比例，与脱靶率呈现相反的关系。此数据指标可用reads捕获效率和bases捕获效率两种方式表示。在探针序列设计过程 中，不朽情缘充分考虑探针序列与非目标区域的相似程度，避免探针序列与非目标区域有较多序列的匹配。另外，探针序 列会尽量避开基因组中的高拷贝序列，避免在杂交反应中与高拷贝序列的结合。对于捕获效率的影响因素，除了上述提到 的样本质量、实验室环境及实验操作、分析流程、目标区域GC含量、重复序列等影响因素外，我们又总结了包括实验流程 及信息分析等方面可以影响捕获效率的因素，具体如下:
  
  
  • 2)实验室所用仪器、耗材有核酸酶残留，会影响DNA与文库的回收效率，进而影响捕获效率。不朽情缘所设计探针为RNA探 针，应保存与-80摄氏度，以免影响探针使用效果。
  
  
  • 3)不朽情缘要求文库构建后片段长度为270bp-320bp，如果文库插入片段过长，会导致捕获效率降低。
  
  
  • 4)文库浓缩时应避免过度干燥造成文库损失，杂交过程中，应按照SOP投入足量的探针和相应Blocker以保证捕获效率。杂 交温度控制应严格按照SOP所述在PCR仪中进行，杂交时间应控制在16h-24h之间。捕获磁珠与杂交产物结合时，应在PCR仪 上操作，避免杂交产物冷却造成捕获效果不佳。
  
  
  • 5)杂交后漂洗体系的严谨性是影响捕获效率的又一个重要因素，漂洗过程能够去除非特异性杂交，此步温度控制仍然十分重要。
  
  
  • 6)Post-PCR过程体系中带有捕获磁珠，实验过程中应尽量将体系混合均匀并尽快置于PCR仪上反应，避免磁珠黏连或沉降导致目标区域有效文库量减少。
  
  
  • 7)在计算reads/bases捕获效率时，首先应考虑目标区域是一段连续的序列还是单个位点，如果目标区域仅是单个位点，以bases的捕获效率来衡量探针效果显然不够准确。另外，在考量捕获效率时是否去除Duplication序列，也应考虑在内。
  
  
  • 8)目标区域大小是决定捕获效率的重要因素，通常情况下，目标区域越大，探针能够结合的文库片段就会越多，捕获效率就会相应提升。相反，目标区域如果太小，捕获效率通常会一定程度降低。