BSA性状定位-不朽情缘-DNABSA性状定位

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BSA性状定位

BSA性状定位—快速定位极端性状基因

BSA（bulked segregant analysis）分离体分组混合分析法，针对目标性状，选择表型极端差异的亲本构建家系，对亲本个体及目标性状表型极端差异的子代混池进行全基因组重测序。根据亲本间纯和差异的位点，在子代池中挑选差异较大的位点进行性状定位。 BSA原理图:

BSA家系构建：家系群体的构建方法有很多种，其中F₂、BC、RIL为常见的可做BSA的群体，常规F₁代由于无性状分离，不可用于BSA性状定位。

常见家系

BSA的分析方法：

1.QTL-seq
适用于自然变异下的材料，定位主效QTL位点。
QTL-seq方法示意图^[1]
2. MutMap
适用于点突变产生的突变体且突变性状为质量性状的材料，MutMap比较适合对EMS诱变的隐性突变基因进行分析。 MutMap 方法示意图^[2]
3.MutMap+
适用于隐性致死突变、不育或者人工杂交困难的物种。 MutMap+方法示意图^[3]
4.MutMap-Gap
适用于研究品系中特有的但在该物种参考基因中缺失的突变位点，或感兴趣的位点是T-DNA外源插入位点的定位。

MutMap-Gap 方法示意图^[4]
5.GPS-BSA
GradedPool-Seq是一种改良的BSA，目的是快速定位复杂性状QTL定位，可对于多个混池测序数据，进行Ridit检验，通过p值筛选显著关联的位点。
GradedPool-Seq方法示意图^[5]
6.PCAMP
PCAMP是一种 QTL-seq 的优化方法，混池个数由2个扩展到N个（N≥3），分析方法由单组混池测序成对比较分析扩展到多组混池测序成对比较分析（Pair-wise Comparison Analysis for Multiple Pool-seq，PCAMP）。 PCAMP定位花青素合成相关基因 ^[6]

不朽情缘优势

1.周期短，定位准，性价比高
基于全基因组重测序的BSA性状定位，可快速准确地找到差异位点，实现目标性状基因的高效定位，具有“周期短、定位准、性价比高”的优势，已广泛应用于植物、作物等有参考基因组的物种。
- 30天
  项目周期
- 6000元起
  项目费用
2.全范围位点挖掘
基于全基因组重测序技术，不朽情缘的BSA性状定位，是对整个基因组进行测序分析，以获得全基因组范围的所有变异信息，力争不错过任何一个与性状相关的位点。
3.高质量测序数据，高性能计算平台
BSA性状定位采用先进的高通量测序平台，快速、高效地读取高质量的测序数据。不朽情缘高性能计算平台（High Performance Computing，HPC）采用DELL计算节点和Isilon存储的高效组合，实现快速稳定的测序数据分析及交付。随着公司业务的发展，高性能计算平台将会持续更新并扩容，以保证高效的数据处理和安全的数据存储。
- PE150
  测序读长
- ≥85%
  测序质量Q30
- 20,280个
  物理核数
- 1,727 ^{T flops}
  计算峰值速度
- 400 ^TB
  总内存
- 58.6PB
  总储存
4.科学方案设计
从材料选取，建库测序，到数据分析，每一步都需要科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果。

材料选取

DNA样品
≥0.5μg

文库构建
350bp

PE150测序
亲本：10×/个体
子代：20×/混池

信息分析
5.出色完成每一个项目环节
至2021年12月，不朽情缘已对作物类、果蔬类、水产、普通植物类等数百种物种进行精确目标性状定位。“科学的方案设计，严格的质控管理，专业的分析团队，丰富的项目经验，优质的项目服务” 确保每一个环节都能出色完成，助力科学研究。
- 50人
  分析团队
- 10年
  项目经验
- 600+
  结题项目
- 1对1
  项目服务

信息分析

基于比对分析发现SNP、InDel标记，随后根据标记进行差异分析，以获取与目标性状相关的基因。

分析内容	解决问题
与参考基因组比对	比对率和覆盖度分析
SNP、InDel检测及注释	开发SNP、InDel标记
子代SNP、InDel频率差异分析	寻找有差异的SNP、InDel位点
目标性状区域定位	找到与目标性状关联的区域
候选基因提取和功能注释	获得候选基因及基因功能

常见问题

1.简化基因组测序适合做 BSA 性状定位吗?
- 针对微效多基因控制的数量性状,与目标性状相关的位点很多,简化基因组或许有幸捕获到少数位点,但绝大部分会被遗漏,这对后续的研究很不利。针对质量性状或由少数主效基因控制的数量性状, 简化基因组BSA的方法风险更高。

2.候选区间如何确定？
- 例如根据计算的SNP-index和delta SNP-index，挑选出SNP-index在两个池中差异较大，delta SNP-index在一定置信水平下的窗口即为候选区间。

3.候选SNP/InDel和候选基因如何确定？
- 为了不忽略微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选出SNP/InDel index在一个池中为1，另一个池中为0的SNP/InDel作为原始的候选SNP/InDel，根据这些SNP/InDel的注释信息，挑选中在外显子上同时引起非同义突变或者stop gain或者stop loss的这些SNP/InDel作为候选SNP/InDel，这些SNP/InDel所在的基因作为候选基因。

4.结果影响因素有哪些？
- 定位效果受群体类型，群体大小，测序深度，群体完整度的影响。

5.经过候选基因筛选,得到目标基因后,如何进行验证?
- 常见验证方法如下:
  （1）验证SNP：(A)将候选SNPs转化成CAPS或dCAPS等标记进行验证。即：对候选的 SNPs进行限制性内切酶识别位点分析，筛选出引起酶切识别位点改变的SNPs，使用相应的引物扩增这些SNPs所在的片段，然后对扩增产物进行酶切和电泳检测，将SNPs转化为CAPS标记；对CAPS标记进行多态性分析,以验证标记的可用性； (B)将候选SNP所在区段进行 PCR扩增，然后利用Sanger测序验证扩增产物；
  （2）利用RT-PCR验证候选基因表达量在不同表型中是否有变化；
  （3）基于转录组的差异表达分析,看基因表达是否有显著差异；
  （4）RNAi 分析：使用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因的表达。

参考文献：

[1] Takagi H, Abe A, Yoshida K, et al. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations[J]. Plant Journal, 2013,74(1):174-183.
[2] Abe A, Kosugi S, Yoshida K, et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(2):174-178.
[3] Rym F, Hiroki T, Muluneh T, et al. MutMap+: Genetic Mapping and Mutant Identification without Crossing in Rice[J]. Plos One, 2013, 8(7):e68529.
[4] Takagi H,Uemura A,Yaegashi H, et al. MutMap-Gap: whole-genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii[J]. New Phytologist, 2013, 200(1): 276-283.
[5] Wang C,Tang S,Zhan Q, et al. Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy[J].Nature Communications, 2019, 10: 2982.
[6] Yang X, Xia X, Zhang Z, et al. Identification of anthocyanin biosynthesis genes in rice pericarp using PCAMP[J].Plant Biotechnol Journal,2019,;17(9):1700-1702.

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