BSA性状定位-经典案例-不朽情缘

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BSA性状定位

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BSA-seq鉴定出菊花托桂花型候选基因和诊断性KASP标记

BSA-seq identified candidate genes and diagnostic KASP markers for anemone type flower in chrysanthemum

期刊：SCIENTIA HORTICULTURAE
影响因子：4.3
发表单位：南京农业大学
发表年份：2023年12月21日

一、研究背景

菊花花型丰富，其中托桂花型因中央管状花高度发达，花冠顶端羽裂成桂花状（即桂瓣），且具有着色丰富、开花持续期长等特点，颇受消费者欢迎。然而，由于菊花自交不亲和，基因组庞大、高度杂合且重复序列多，导致托桂花型的遗传机制和分子标记研究严重滞后。本研究在团队近期破译六倍体栽培菊花基因组基础上，利用基于重测序的BSA-seq挖掘菊花托桂花型形成的关键候选基因和位点，并开发KASP功能型分子标记，以期加快菊花托桂花型新品种选育。

三、研究结果

1. 菊花F1代托桂花型分离与混池构建
以托桂菊花品种‘南农雪峰’（XF）为母本，‘蒙白’（MB）为父本进行杂交，获得F1群体（n = 167）。连续多年记录各F1子代的花型，发现该群体的托桂与非托桂花型分离比例为3:1，且托桂程度存在连续性变化，表明菊花托桂花型由显性多基因控制。选取典型托桂花型株系28个和典型非托桂花型株系20个，分别将检测合格的DNA等量混合，构建托桂池（BA）和非托桂池（BS），连同两个亲本DNA样本进行全基因组重测序。
2.变异检测与BSA-seq
以栽培菊花品种‘钟山紫桂’基因组为参考，进行序列比对和变异检测。四个样本XF、MB、BA和BS的比对率分别为99.29%、99.20%、99.17%和99.15%，1×覆盖率百分比在89.25%以上，混池测序平均深度为20.97×。为尽量控制背景噪音，首先根据完整度和多态性对SNP/Indel位点进行过滤。采用|Δ(SNP/InDel-index)|和欧式距离ED两种算法共同检测出42个一致性关联区域，区间长度累计30 Mb，主要分布于部分同源染色体组Chr4-Chr5-Chr6（图2）。
3. 菊花托桂花型候选基因注释及相对表达量分析
在候选区间内，通过基因功能注释以及典型托桂/非托桂品种管状花组织的RNA-seq分析，筛选出22个候选基因。进一步通过qRT-PCR实验发现，evm.model.scaffold_915.436（CBF5）、evm.model.scaffold_24.208（U2AF65A）和一个未知功能新基
evm.model.scaffold_260.201在托桂/非托桂极端F1株系管状花中的表达量均存在显著性差异，推测其可能为控制菊花托桂花型的关键候选基因。
4.KASP标记开发与验证
为了精准高效地筛选托桂花型材料，将与菊花托桂花型紧密连锁的SNP/Indel位点成功开发出了四个KASP标记。其中Chr6__33961007和Chr6__179207697两个KASP标记的基因分型联合分析可有效区分托桂和非托桂花型，为菊花花型分子标记辅助育种奠定了重要基础。

四、研究结论

利用BSA-seq和RNA-seq组学分析挖掘控制菊花托桂花型形成的重要候选基因和位点，开发的KASP标记可以实现托桂品种的早期高通量筛选，大大提高了菊花托桂花型分子标记辅助选择育种效率，也可为菊花其他重要园艺性状的正向遗传学研究提供借鉴。

用BSA方法定位水稻耐盐性性状

MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar

期刊：Nature Biotechnology
影响因子：39.08
发表单位：Iwate Biotechnology Research Center, Kitakami, Iwate, Japan
发表年份：2015年3月

一、研究背景

2011年地震和海啸导致日本大面积的稻田被海水淹没而造成盐污染，但日本当地缺少耐高浓度盐的水稻品种，急需培育耐盐性的水稻新品种。

二、方法流程

取材

建库

测序

分析

1. 地方品种Hitomebore进行EMS诱变得到耐盐突变体hst1；
2. Hitomebore与hst1 杂交构建F₂ 分离群体；
3. 取20株F₂分离群体中的耐盐性个体进行混池。

1. 野生型亲本Hitomebore提取DNA，单独建库。
2. 20株F₂子代提取DNA后进行等量混合，构建子代DNA
池再进行建库。

1. HiSeq 2500测序；
2. 亲本测序深度≥20X；子代测序深度≥18X。

1. 比对参考基因组
2. 群体SNP检测及基因分型
3. SNPindex差异分析
4. 目标性状定位
5. 候选基因挖掘及功能验证

三、研究结果

1. 耐盐突变体hst1 筛选
通过对当地水稻品种Hitomebore进行EMS诱导筛选得到的水稻突变体hst1 能在0.75%的NaCl浓度下保持青绿，抗盐能力强，适用于进一步研究。
2. 全基因组BSA耐盐性状定位
将目标区域锚定在6号染色体上2.76 Mb~8.57 Mb区间，该候选区域其中1个SNP的突变使一个无义色氨酸密码子突变为终止子，所在基因为OsRR22，导致突变体hst1 产生耐盐表型。
3. 耐盐突变体hst1 抗盐机理验证
通过进一步实验验证，证明是OsRR22基因中转座子Tos17 的插入致使该基因部分功能缺失，使得突变体hst1 产生耐盐表型。通过RNA-seq证明耐盐突变体hst1 只影响了小部分基因的表达，所以研究者通过表型验证发现耐盐突变体hst1 的产量和品质等均与其亲本无差异。
4. 耐盐品种培育
为解决实际生产问题，以耐盐突变体hst1 作为母本，以Hitomebore为父本进行杂交，最终培育出品种"Kaiji"，该品种保留了其亲本优良的产量性状和品质性状的同时，其耐盐性也与突变体hst1 保持在同一水平上。该品种于2015年于当地推广，在短短的两年时间内培育出了耐盐品种"Kaiji"。

四、研究结论

通过对日本地方水稻品种Hitomebore进行EMS诱变，从6,000株突变体中筛选得到耐盐性的突变体hst1 。将耐盐性突变体hst1 与野生型亲本Hitomebore杂交，构建F₂分离群体。运用全基因组BSA策略，从F₂子代群体中选取20个极端耐盐个体混池后与野生型亲本（Hitomebore）一起进行全基因组重测序，结合Mutmap分析方法，找到控制水稻耐盐性的候选基因OsRR22。通过进一步实验验证，证明是OsRR22基因中转座子Tos17 的插入致使该基因部分功能缺失，使得突变体hst1 产生耐盐表型。本研究仅用两年时间培育出了耐盐性的水稻新品种，为快速进行作物育种提供了新思路。