1. 三代微生物

• 1.1 单菌组织样本（细菌，真菌）

  • (1)样本量：菌体≥3g，-80℃保存，干冰寄送。
    (2)样本准备：对数期细菌（50ml）菌液，4000×g 离心 10min（4℃），弃上清，沉淀（离心后至少3g）用无菌水洗 2 次后干冰送样，建议送 2-3个平行，避免一次提取不成功。
    真菌（100mL）菌液，4000×g 离心 10min（4℃），弃上清，沉淀用无菌水洗 2 次后干冰送样，若是新鲜真菌建议 3g 以上，建议送 2-3个平行，避免一次提取不成功。
    (3)提取成功的样品类型：鲍曼不动杆菌，沃氏葡萄球菌，肠炎沙门氏菌，埃希氏菌，粪肠球菌，葡萄球菌，不动杆菌，放线菌，链霉菌等。
    (4)注意事项：
    a）甘油保存，需要重新液体培养基（例如 LB）活化到对数期，不可直接送甘油保存的菌株；
    b）不建议送固体培养皿的菌，如是只有固体培养基才能活，可以刮到有 PB 缓冲液的离心管里面，离心，送沉淀 2g 以上；
    c）真菌（5g）大型菇类等，建议送菌丝，不建议送孢子或是子实体，杂合率较高，不利于组装；
    d）样本一定为非灭活样本，灭活会导致核酸严重降解。

• 1.2 三代扩增子组织样本

  • (1)样本量：

    样本类型	建议送样量	最低送样量
    土壤／污泥／沉积物／腐殖质	3-5g	1g
    水体滤膜 （孔径0.22-0.45μm／直径3-4cm）	2-3张	1张
    拭子	3-5个	1个
    瘤胃液／发酵液／组织液 （离心有明显沉淀）	3-5mL	1mL
    粪便／肠道内容物	3-5g	1g
    动物／人组织	1-3g	1g
    血浆	3-5mL	1mL

    (2)样本运输：-80℃保存，干冰寄送。
    (3)提取成功的样品类型

    项目类型	样本类型
    16s	土壤、粪便、淤泥、人和动物组织样本、水体、酒糟（发酵液）、棉签拭子、瘤胃液、菌体
    18s	土壤、粪便、淤泥、水体、酒糟（发酵液）、藻类
    ITS	土壤、粪便、淤泥、沉积物、人和动物组织样本、水体、酒糟（发酵液）

• 1.3 三代宏基因组组织样本

  • (1)样本量：

    样本类型	建议送样量	最低送样量
    土壤／污泥／沉积物／腐殖质	6g	2g
    水体滤膜 （孔径0.22-0.45μm／直径3-4cm）	6张	2张
    空气滤膜 （直径种类多，与采样器搭配，有明显颜色沉淀在滤膜上）	6张	2张
    拭子	10-20个	6个
    瘤胃液／发酵液／组织液／冲洗液 （离心有明显沉淀）	6-10mL，沉淀2g	2mL，沉淀1g
    粪便／肠道内容物	5g	2g
    动物／人组织	2g	1g
    牛奶／酸奶	100mL／100g	20mL／10g
    食糜	4g	2g
    食品表面拭子	20个	10个

    (2)样本运输：-80℃保存，干冰寄送。
    (3)提取成功的样品类型： 土壤、水体、粪便、肠道内容物、发酵液等。

• 1.4 核酸样本（微生物）

  • 1.4.1 单菌DNA送样量要求

    （1）纯度要求：OD260/280=1.8~2.0，DNA 条带单一，无杂带，无 RNA、蛋白质等杂质污染； （2）样品浓度和总量要求：

    产品	送样量
    PB单菌	浓度≥70ng/μL，总量≥5μg
    ONT单菌	浓度≥60ng/μL，总量≥6μg

    （3）细菌和真菌 DNA 样本，请老师首先进行污染排查检测和物种鉴定，污染排查和物种鉴定方法：细菌可以扩增 16s 全长后送一代测序，真菌还需扩增 ITS全长，确定物种正确，无其他杂菌污染再送样。
    （4）注意事项：
    ①菌液应当为对数生长时期；
    ②霉菌和蕈菌可能存在二倍体杂合度比较高的情况，而且也可能包含其他杂菌，如果直接提取 DNA 送样，会影响后续染色体组装效果，建议先进行纯化培养，多传几代，可以取孢子分离纯培养，然后再提取 DNA 送样。

  • 1.4.2 三代扩增子DNA送样量要求?

    • 1.4.2.1 DNA样本

      （1）样品浓度：DNA≥10 ng/μL，总量：DNA≥150 ng；
      （2）需客户提供电泳图；
      （3）送样时请使用干冰或冰袋运送（建议用干冰）；
      （4）DNA 要有明显主带，无降解，无 RNA、蛋白质等杂质污染，例如如下电泳图： 注：图中标为标准品，上样5μL（10ng/μL）；M-1为Trans 2k plus，上样2μL；M-2Trans 15k plus，上样2μL；白色数字为样本序列号，原液上样5μL。

    • 1.4.2.2 PCR样本（包cell）

      （1）PCR产物浓度≥20 ng/μL，PCR 产物总量≥2μg(支持1次文库构建）；
      （2）PCR产物要经过纯化（如胶回收纯化），确保条带单一，无降解，无引物二聚体；
      （3）PCR 产物需带有双端Barcode序列（注意区别于二代barcode序列，每个样本有成套barcode序列）；
      （4）需客户提供电泳图；
      （5）送样时请使用干冰或冰袋运送。

  • 1.4.3 三代宏基因组DNA送样量要求

    （1）样品总量：DNA浓度 ≥80 ng/μL，DNA总量≥5 μg（nanopore平台）或 DNA总量≥10 μg（Pacbio平台）；
    （2）纯度要求：OD260/280=1.8-2.0，无 RNA、蛋白质等杂质污染；
    注：三代样本1为pass类样本，脉冲场电泳，主带在30K以上，基因组轻微断裂，轻微降解。
    （3）注意事项：人或动物组织样本宏基因组，要避免宿主DNA的污染，如果宿主基因组序列占环境DNA比例较高，测序后得到的有效数据量很低，且我们无法通过已知宿主基因组序列去污染，会对后续分析结果造成较大影响。建议可通过以下方法尽量避免宿主DNA的污染：
    ① 取样时，尽量不要取靠近组织的部位；
    ② 提取时，采用适用于样本类型的 DNA 提取试剂盒；
    ③ 如果宿主有参考基因组，可以通过比对去除宿主基因组污染。

  • 1.4.4 样本检测方法

    (1) Invitrogen Qubit?Fluorometer
    (2) Agarose Gel Electrophoresis
    (3) NanoDropTM/酶标仪
    (4) Agilent 2100 Bioanalyzer

  • 1.4.5 样本检测使用量

    样本类型	Qubit?	AGE	Agilent 2100	NanoDropTM/酶标仪	稀释度
    DNA样品	1-3μL	100ng或5μL(低浓度样品)	1.5-3μL	1-2μL	如样品浓度 >= 200ng/μL 将用TE缓冲液稀释原液

  • 1.4.6 DNA样本质控说明

    DNA样本质量图示。
    （1）质量好的DNA样本（推荐）：
    • 
    （2）质量差的DNA样品（不推荐）： DNA样本风险文库构建风险：
    1. 总量不足：可能导致 a. 文库构建失败；b. 文库产量低不能上机测序或测序数据量不足；c. 影响文库随机性；d. 导致数据产量和覆盖度偏低；
    2. 样品降解（尤其基因组样品）：影响覆盖均一性和随机性；可造成duplication偏高等。
    3. 含有杂质样本：可能造成文库构建失败，建议纯化后送样。
    • 
    • 
    • 

2 样本打包及寄送建议

• 2.1 样本的打包

  （1）核酸样品建议使用质量好的1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品，并用封口膜封口。为了防止样品管破裂，或者污染和混乱，请不要使用诸如PCR管、0.5ml EP管、八联管、96孔板、深孔板等非标准管送样。非标准管不利于样品保存以及后续实验的进行。如有样品使用非标准管制备，还请在送样前自行转管处理。
  （2）组织样本建议根据送样量使用合适规格带螺纹帽的EP管、冻存管或者离心管装载组织样品，并用封口膜封口。
  （3）为防止样品管在运输过程中受到干冰挤压破裂，最好将样品管放到50ml离心管或其他支撑物中，并在支撑物里添加棉花或卫生纸缓冲。大量样品建议将EP管放置在冻存盒中，并在冻存盒外面包裹气泡垫。如使用锡箔纸、自封袋装载的样品，为防止运输中受挤压破损，建议将锡箔纸折叠整齐装在自封袋中，在样品包装外再用气泡垫包好并固定。
  （4）对于血液样品，建议采用5-10ml 塑料抗凝采血管装载，为了防止运输过程中采血管因挤压而损坏，需要将每支采血管管身均用气泡垫包好，然后放置到塑料或纸质包装盒中。
  （5）用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发出，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。
  （6）为便于处理和保存，组织样品送样量请不要超过建议送样量的5倍（特殊的得率较低的样品除外）。

• 2.2 样本的名称标识

  （1）所有的样品必须具有清晰的标记，并且简洁明了。
  （2）使用锡箔纸包装的组织样品建议在锡箔纸内外均标记样品名称，并将锡箔纸放在自封袋中，自封袋外面再标记上样品名称，防止锡箔纸上样品名称模糊引起样品混乱。
  （3）使用乙醇沉淀的核酸样品，由于挥发出的乙醇会使记号笔的标记模糊，建议用油性记号笔将样品名称写在标签纸上，然后用透明胶带将标签纸粘贴在样品管壁上，并缠绕2-3圈。
  （4）样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖。其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。所有标注内容需与《样品信息单》保持一致。