10X Visium空间转录组送样建议-不朽情缘

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10X Visium空间转录组

1. 新鲜或冷冻组织OCT包埋方法
2. 新鲜组织冻存操作方法
3. 多组织同时包埋操作方法
4. 空间转录组和单细胞转录组联合取样操作方法
5. 空间转录组样本运输建议

声明：
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》（点击查看）的所有样品。对于高毒性动植物等样品，必须事先通过销售、客服或运营经理与不朽情缘技术人员联系，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项：核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系，尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸，请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本，建议自行提取。取样过程中，需要全程佩戴手套，并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒，以免样本污染

1.新鲜或冷冻组织OCT包埋方法

1.1 所需试剂及耗材

名称	厂商	货号	备注
OCT组织包埋剂	日本樱花SAKURA	PN-4583	湿冰或4℃冰箱预冷≥30min
组织包埋盒	/	/	包埋盒大小：17175mm
干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
实验用吸水纸	/	/

Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备

1.2 准备工作
（1）将干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
（2）将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）
（3）准备好冷冻组织包埋盒，记号笔标注好样品信息及方向。
Tips：使用太小的组织包埋盒，容易使包覆样本的OCT包埋剂过少，可能造成组织裸露，从而影响组织RNA质量。
图1 试剂耗材预冷、包埋盒标记
1.3 取样
（1）尽量收集新鲜组织样本，避免室温长时间放置，避免污染；临床样本建议将组织放在干净的离心管或密封袋中，埋入湿冰中短暂保存和运输（小于30min）。
（2）使用实验用吸水纸吸干组织表面血渍或水渍，尽量避免使用PBS或组织清洗液润洗组织，新鲜组织样本截面大小应不超过6.5mm x 6.5mm。5mm≤高度≤12mm，如样本过大，建议在速冻前先将组织分割成多个小块，样本过大可能会导致组织冷冻不均匀。
Tips1、如组织样本表面较软，不易修剪，可提前将锡箔纸铺到干冰上，将组织放到锡箔纸上进行预冷，表面稍许变硬后再进行修剪；
Tips2、如样本较薄，可同时制备包埋多份样本，以保证样本足够用于质检、透化和正式实验；
Tips3、如样本较厚，需准备高度适宜的包埋盒或将一个包埋盒底部去除，再将另一个包埋盒与其进行叠放，以增加样品包埋高度。
图2 吸水纸组织表面清理、包埋盒底部去除
1.4 包埋
（1）将组织包埋盒放到干冰盒内，向包埋模具内注入少量经过湿冰预冷的OCT，注意不要产生气泡。
（2）将上述修剪好的组织块或冰冻组织找好角度，水平放置在组织包埋盒中。
（3）继续注入OCT包埋液直至整个组织块被完全包埋。
Tips1、自中心点沿时针方向连续轻柔挤出，可有效避免气泡的产生，如产生气泡，可用镊子或细枪头将气泡挑破或向外侧挤出。
Notice：将所关注的切面平行于包埋盒底部进行包埋，关注的切面朝下放置，我司实验室收到样品后按照平行于包埋盒底部的角度进行切片，如有特殊情况需提前告知。
1.5 速冻
组织包埋盒继续放置在干冰上并盖上干冰盒盖子，速冻10min-20min直至包埋剂变硬变白，并在边缘标记数字，两种标记方式均可，后续阐述清楚切片方向即可（后续需告知实验人员切片方向，例如：1→3）。
图3 OCT包埋冷冻
1.6 保存
包埋后的组织固定在包埋盒中，转入自封袋内标记好送样信息即可干冰寄送样本。如暂不送样，则需要将包埋块密封好后放在-80℃冰箱中冻存。
Notice：必须密封储存样本，否则可能会导致组织脱水和损伤。

2.新鲜组织冻存操作方法

2.1 所需试剂及耗材

名称	厂商	货号	备注
异戊烷	Sigma	270342
液氮	/	/
干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
液氮及异戊烷容器	/	/	/
医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
实验用吸水纸	/	/

Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备

2.2 准备工作
（1）干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
（2）将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）。
（3）准备金属容器，在金属容器中倒入2/3体积的异戊烷，再将金属器皿放在液氮中，制备成异戊烷液氮浴装置，异戊烷在液氮中预冷10-15min。
Tips1、异戊烷液氮浴装置中，液氮和异戊烷处于同一水平线；
Tips2、异戊烷预冷时间长会出现结冰情况，如未满15min即出现结冰现象，则可以缩短预冷时间，当异戊烷结冰时，可将异戊烷从液氮中取出室温放置一小段时间。
图4 异戊烷液氮浴装置
2.3 取样
取样过程同“1 新鲜或冷冻组织OCT包埋方法”
2.4 冷冻
（1）用镊子将组织放入异戊烷，完全浸入液面1min至完全冷冻，冷冻时间根据组织类型和大小而有所不同。
（2）冷冻后，迅速将组织转移到提前预冷的低温冷冻管中，并放置在干冰上。
Notice：请不要直接使用液氮对组织进行速冻，组织表面与液氮的巨大温差会导致液氮在组织表面沸腾，可能会导致气泡空腔或不均匀冷冻，最终影响组织形态。图5 低温冻存管保存组织
2.5 保存
将放入冷冻管内的冷冻组织密封好放入样本存放盒或密封袋中，标记好样本信息，放在-80℃长期保存。开展实验前，可将冷冻样本取出后按照“1 新鲜或冷冻组织包埋操作方法”的流程完成样本包埋工作。

3.多组织同时包埋操作方法

为提升芯片点阵利用效率，对于有些较小的组织类型，可以选择将多个组织同时包埋在一起，切片贴片后，实现一个芯片点阵铺贴多个组织。进行此类包埋时需要注意以下几个方面：
（1）为确保组织切片不超过点阵大小，同时不同组织间互不影响，多块组织放置时总长×宽 ≤6.5*6.5mm，两块组织间距需大于1mm。
（2）为保证切片时不同组织的关注区域均能被同时切到，多块组织需要被包埋在同一水平面，同时关注的切面方向要保证一致。
（3）为确保后续实验顺利开展，同一包埋块中的组织取样方法必须一致，组织类型及组织亚型必须相同（例如早期-胃体癌-腺癌），以保证同一包埋块内的所有组织的透化时间一致。
（4）除以上注意事项外，多个组织包埋方法与单个组织操作相同。

图6 多组织同时包埋操作方法

4.空间转录组和单细胞转录组联合取样操作方法

针对同时开展空间转录组和单细胞转录组测序实验的情况，需要在取样时同时制备两份以上样本，操作如下：
（1）手术取样后，将组织分别按照空间转录组和单细胞转录组要求的大小分为三份：
空间转录组要求：长×宽 ≤ 6.5mm×6.5mm，5mm ≤高度≤ 12mm;
单细胞要求：大于200mg的组织（黄豆粒大小）;
建议保留备份样本；
Notice：单细胞实验过程默认使用全部组织，如有特殊需求，务必提前告知。
（2）将取好的空间转录组样本放入有盖培养皿或其它密闭容器在湿冰上转移至实验室，后续严格按照上述方法进行组织包埋或者冻存。
（3）将取好的单细胞转录组样本放入组织保存液或RPMI-1640 (Fisher Scientific) 培养基中置于冰上转运至实验室，用PBS洗掉组织中的血液，后续严格按照“不朽情缘单细胞样本寄送说明文档”进行操作；
（4）为防止样本混淆，造成不必要的麻烦，制备好的空间转录组样本与单细胞样本建议分开寄送 。
（5）为保证单细胞实验质量，单细胞实验样本类型依次推荐顺序为（新鲜样本悬液制备>新鲜样本提核>冷冻样本提核）；
（6）如果收集的样本为小鼠模型样本，当单只小鼠样本量不足时，则可以选择同时建模的两只或多只小鼠样本分别按照空间转录组和单细胞转录组要求取样；

5.空间转录组样本运输建议

干冰运输
将样品从冻存环境中取出，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，样品的四周都需用干冰填满，将泡沫盒密封好后邮寄至不朽情缘样本组。24小时内能够到达，干冰重量不得低于5kg；48小时内能够到达，干冰重量不得低于10kg；72小时内能够到达，干冰重量不得低于15kg。
收件人：不朽情缘样品组
电话：18526699037
邮寄地址：天津市武清开发区创业总部基地B07