1.样本类型

2.送样地址

3.OCT包埋冰冻组织块送样要求

• 3.1 冰冻样本送样要求

  密封后，-80℃保存。在OCT包埋盒外注明切割面，干冰运输（OCT包埋块没有年限要求，以质检结果RIN值为准）；
  建议组织截面积＜35.3mm×14.1mm。

• 3.2 OCT包埋方法及注意事项

  3.2.1所需试剂及耗材

  名称	厂商	货号	备注
  OCT 组织包埋剂	日本樱花SAKURA	PN-4583	湿冰或4℃冰箱预冷≥30min
  组织包埋盒	/	/	包埋盒大小：17*17*5mm
  干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
  医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  实验用吸水纸	/	/

  Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备
  3.2.2准备工作
  （1）将干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
  （2）将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）。
  （3）准备好冷冻组织包埋盒，记号笔标注好样品信息及方向。
  Tips：使用太小的组织包埋盒，容易使包覆样本的OCT包埋剂过少，可能造成组织裸露，从而影响组织RNA质量。 图1 试剂耗材预冷、包埋盒标记 3.2.3取样
  （1）尽量收集新鲜组织样本，避免室温长时间放置，避免污染；临床样本建议将组织放在干净的离心管或密封袋中，埋入湿冰中短暂保存和运输（小于30 min）。
  （2）使用实验用吸水纸吸干组织表面血渍或水渍，尽量避免使用PBS或组织清洗液润洗组织，新鲜组织如样本过大，建议在速冻前先将组织分割成多个小块，样本过大可能会导致组织冷冻不均匀。
  Tips① 如组织样本表面较软，不易修剪，可提前将锡箔纸铺到干冰上，将组织放到锡箔纸上进行预冷，表面稍许变硬后再进行修剪；
  Tips② 如样本较薄，可同时制备包埋多份样本，以保证样本足够用于质检、透化和正式实验；
  Tips③ 如样本较厚，需准备高度适宜的包埋盒或将一个包埋盒底部去除，再将另一个包埋盒与其进行叠放，以增加样品包埋高度； 图2 吸水纸组织表面清理、包埋盒底部去除 3.2.4包埋
  （1）将组织包埋盒放到干冰盒内，向包埋模具内注入少量经过湿冰预冷的OCT，注意不要产生气泡。
  （2）将上述修剪好的组织块或冰冻组织找好角度，水平放置在组织包埋盒中。
  （3）继续注入OCT包埋液直至整个组织块被完全包埋。
  Tips：自中心点沿时针方向连续轻柔挤出，可有效避免气泡的产生，如产生气泡，可用镊子或细枪头将气泡挑破或向外侧挤出。
  Notice：将所关注的切面平行于包埋盒底部进行包埋，关注的切面朝下放置，我司实验室收到样品后按照平行于包埋盒底部的角度进行切片，如有特殊情况需提前告知。
  3.2.5速冻
  组织包埋盒继续放置在干冰上并盖上干冰盒盖子，速冻10min-20min直至包埋剂变硬变白。 图3 OCT包埋冷冻 3.2.6保存
  包埋后的组织固定在包埋盒中，转入自封袋内标记好送样信息即可干冰寄送样本。如暂不送样，则需要将包埋块密封好后放在-80℃冰箱中冻存。
  Notice：必须密封储存样本，否则可能会导致组织脱水和损伤。

• 3.3 新鲜组织冻存操作方法

  3.3.1 所需试剂及耗材

  名称	厂商	货号	备注
  异戊烷	Sigma	270342
  液氮	/	/
  干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
  液氮及异戊烷容器	/	/	/
  医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  实验用吸水纸	/	/

  Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备
  3.3.2准备工作
  （1）干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
  （2）将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）。
  （3）准备金属容器，在金属容器中倒入2/3体积的异戊烷，再将金属器皿放在液氮中，制备成异戊烷液氮浴装置，异戊烷在液氮中预冷10-15min。
  Tips① 异戊烷液氮浴装置中，液氮和异戊烷处于同一水平线；
  Tips② 异戊烷预冷时间长会出现结冰情况，如未满15min即出现结冰现象，则可以缩短预冷时间，当异戊烷结冰时，可将异戊烷从液氮中取出室温放置一小段时间。 图4 异戊烷液氮浴装置 3.3.3取样
  取样过程同“3.2.3取样”
  3.3.4冷冻
  （1）用镊子将组织放入异戊烷，完全浸入液面1min至完全冷冻，冷冻时间根据组织类型和大小而有所不同。
  （2）冷冻后，迅速将组织转移到提前预冷的低温冷冻管中，并放置在干冰上。
  Notice：请不要直接使用液氮对组织进行速冻，组织表面与液氮的巨大温差会导致液氮在组织表面沸腾，可能会导致气泡空腔或不均匀冷冻，最终影响组织形态。 图5 低温冻存管保存组织 3.3.5保存
  将放入冷冻管内的冷冻组织密封好放入样本存放盒或密封袋中，标记好样本信息，放在-80℃长期保存。开展实验前，可将冷冻样本取出后按照“3.2.3取样”的流程完成样本包埋工作。

4.FFPE蜡块送样要求

• 4.1 FFPE样本送样要求

  石蜡包埋块密封后4℃保存，冰袋寄送（蜡块没有年限要求，以质检结果DV200为准）;
  建议组织截面积＜35.3mm×14.1mm。

• 4.2 石蜡组织包埋方法及注意事项

  4.2.1样本预固定处理
  （1）样本来源分类：
  A切除标本（手术活检），在手术时切除整个器官或受累部位——大样本剖开但不切断方式进行充分固定；
  B切口活检标本，从受累部位内取下组织——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  C钻孔活检，通过钻孔取出一小块可疑组织（通常来自皮肤）——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  D刮拭活检，从表面（通常是皮肤）上“刮取”较小的组织碎片——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  E刮宫，从子宫或宫颈的黏膜上刮取小片组织——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  F空芯针穿刺活检，有时使用一根特殊的针穿过皮肤（经皮）取出少量组织样本——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  B-F类的组织若过于细小，可以用两片浸湿的滤纸，将其夹在中间；
  本步骤中强调：
  （1）仔细检查样本信息和随附文件一一对应，所有详细信息均有记录，并可以做到“标本追踪”。
  （2）切除后的新鲜组织，为了防止变性或干燥，应尽快固定（样本离体30min内尽快放入10-15倍体积中性缓冲福尔马林固定液中）。标本好越早开始固定，结果越好，并在样本袋外标签处填写详细样本编号等识别信息。
  （3）在处理标本之前，应将体积大的样本浸入福尔马林20小时进行固定。
  4.2.2样本目的部位取材
  （1）涉及对标本进行仔细检查和描述，包括外观、标本块数量及其尺寸。
  A取出预处理的样本，较大的标本需要进一步切开，从目的部位切下2~4mm厚的切片代表性组织块。
  B取出预处理的样本，对于较小的标本，可以处理整个标本，将其直接放在包埋盒（小孔篮）中。 图6 石蜡预处理样本 4.2.3样本脱水浸蜡
  处理大批量标本时，一般使用“组织处理机”的自动化仪器。这些仪器可以在熔化石蜡加工的一系列不同的溶剂中浸润标本，标本一开始处于水环境中（水基），且必须通过溶剂（通常为乙醇和二甲苯）脱水和清除的多次变化后才能放入熔化的蜡（疏水且不混溶于水）中。对特定批次标本选择的“处理时间表”的持续时间和步骤详细信息取决于标本的性质和大小。对于较小的标本，时间表可短至几个小时，对于较大的标本，时间表可长达12小时或更长； 4.2.4样本石蜡包埋
  将标本从包埋盒中取出并放入蜡填充的模具中。在这个阶段，应仔细定向标本，因为这将决定切割切片的平面，一般以模具底面为目的截面，也就是最终在显微镜下观察的组织截面。
  在组织已处理的包埋盒中带有标本识别详细信息，现在将包埋盒放在模具顶部，并添加更多蜡来将其黏附固定。现在，标本“块”可在一个冷表面上固化，固定后即可移除模具。包埋盒现在充满了蜡并形成了“块”的一部分，此步骤也为了夹入切片机提供了稳定的底座，将其牢固夹在切片机的标本架中，从块表面切下切片（如图所示）。 图7 A为模具中的样本固定，B为夹在标本架中的样本 4.2.5注意事项
  （1）组织离体时间：组织块离体后应尽快固定，缺血离体时间不宜超过1h。
  （2）组织固定液：推荐10%NBF或4%PFA，10%NBF穿透力强，4%PFA穿透力弱一些。
  （3）固定时间：根据组织块大小决定，0.5cm直径组织块一般固定18-24h，时间不宜过长。
  （4）存放条件：蜡块存放环境需保持干燥，可放入干燥器，室温保存。干燥器如下图所示： 图8 干燥器

5.冰冻切片/ FFPE切片送样要求

• 5.1 冰冻切片

  切片厚度~5μm；
  贴片后，放入载玻片盒，再装入密封袋密封，-80℃保存，干冰运输。

• 5.2 FFPE切片

  切片厚度4~6μm；
  根据样本大小，每个样本首先需要切5-10张蜡卷，单独放入离心管中，冰袋寄送至公司进行质检（DV200）；
  样本质检合格后，再使用粘附性载玻片贴片，干燥后放入载玻片盒，再装入密封袋密封，冰袋运输。

• 5.3 送样量

  寄送 ≥ 5张贴片（样本为邻片），建议贴片面积＜35.3mm×14.1mm。
  ※寄送的5张贴片，3张由不朽情缘进行免疫荧光成像质控，1张由不朽情缘进行DSP正式建库测序，1张用于备份。
  Notice：为了避免RNA降解带来的影响，切片需要尽量在14d以内完成DSP正式建库，建议老师切片后尽快寄送。

• 5.4 注意事项

  （1）切片选择：
    包埋块修片前几张切片不用于试验，挑选远离包埋块表面的切片。
  （2）贴片要求：
    1）使用具有粘附性或带正电荷的防脱载玻片进行贴片，组织需位于载玻片中央（下图绿色矩形区域，最大面积为35.3 mm × 14.1 mm），超出绿色矩形的组织区域将不能被建库测序；   注：防脱载玻片没有品牌限定，可使用常见的世泰牌粘附载玻片（货号：188105W）。部分疑难样本（骨，脂肪，皮肤等）使用粘附性载玻片仍有较高的脱片风险，需要根据实际情况判定。 图9：浅蓝色边框为载玻片大小；深蓝色六边形为仪器固定区域；绿色矩形为贴片区域和仪器捕获范围   2）切片、贴片时避免产生划痕和褶皱，谨防后续试验中样本信息获取不完整或脱片；
    3）贴好FFPE样本的载玻片需在加热托盘或烘箱进行烤片；烤片后的玻片室温干燥储存、可放置于干燥器内。或载玻片置于载玻片盒，装入密封袋保存（密封袋中可放干燥剂）。
    4）建议使用新切切片进行贴片。