ATAC-seq-经典案例-不朽情缘

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ATAC-seq（mini ATAC-seq）

案例一、流感训练的粘膜常驻肺泡巨噬细胞在肺部具有长期的抗肿瘤免疫功能

期刊以及IF：Nature Immunology；31.25
合作单位：浙江大学姚雨石团队
研究材料：未感染/IAV感染小鼠肺泡巨噬细胞（AM）
测序产品：ATAC-seq、RNA-seq
关注重点：抗肿瘤免疫、肺泡巨噬细胞、流感训练
研究意义：有助于理解呼吸道黏膜组织 AM 的训练免疫（比如病毒感染）如何帮助固有免疫系统发挥抗肿瘤免疫监视作用，揭示组织驻留巨噬细胞可作为基于训练免疫的抗癌策略的潜在靶点。

一、研究思路

二、研究结论

2.1 急性IAV感染诱导持久的肺部特异性抗肿瘤免疫，且依赖于肺泡巨噬细胞（AM）
为探究呼吸道病毒感染是否对肺部抗肿瘤免疫产生长期影响，作者构建了甲型流感病毒（IAV）感染后30天的小鼠黑色素瘤或乳腺癌肺转移模型。与未感染的小鼠(PBS)相比，IAV感染小鼠的肺部肿瘤负荷减少，生存期延长，且抗肿瘤免疫在IAV感染4个月后仍能抑制癌细胞的肺转移，表明IAV感染诱导抗肿瘤免疫的持久性。进一步通过体内选择性AM清除和AM过继回输等实验发现， IAV感染后的AM而非T细胞在肺部抗肿瘤免疫中发挥关键作用，其抗肿瘤作用具有肺脏组织特异性。
2.2 IAV感染诱导AM训练免疫
对未感染（PBS）小鼠（对照组）和IAV感染小鼠（处理组）的AM进行测序多组学分析（每组设置3个生物学重复）。
1）RNA-seq表明两组AM基因表达间存在巨大差异；
2）ATAC-seq染色质可及性分析发现IAV AM中的免疫激活/应答功能相关的基因的染色质可及性增加；
3）转录组GSEA结果表明IAV AM中富集到与训练免疫密切相关的通路。
图1 RNA-seq差异表达火山图

图2 ATAC-seq染色质可及性热图
多组学数据分析表明IAV感染的AM形成训练免疫/天然免疫记忆。从机制上讲，IAV感染诱导的训练型AM能够浸润到肺部肿瘤病灶发挥抗肿瘤作用，其吞噬能力和肿瘤细胞毒性增强；这种抗肿瘤作用并不依赖于T细胞。
2.3 记忆性的AM可抵抗肿瘤诱导的免疫抑制微环境
利用ATAC-seq和RNA-seq多组学分析记忆性AM的功能表征。比较IAV-B16和PBS-B16 AM的ATAC-seq结果发现：
1）ATAC-seq差异分析：PBS-B16 AM中染色质可及性增强的相关基因中部分与免疫功能负调节相关，而染色质可及性降低的相关基因中部分与免疫激活途径相关；
2）ATAC-seq的KEGG功能富集分析表明，IAV-B16 AM与免疫激活和训练免疫相关的基因的染色质可及性增加；
3）ATAC-seq信号变化基因的转录组GSEA结果显示：IAV-B16 AM中富集到与抗肿瘤免疫功能密切相关的通路，表明在肺肿瘤微环境中，IAV AM的抗肿瘤功能比PBS AM强。整合多组学分析结果，研究认为记忆性AM在表观遗传学和转录组水平上可抵抗肿瘤诱导的免疫抑制微环境。
图3 IAV-B16与PBS-B16小鼠的AM中的染色质可及性变化
图4 与免疫激活和训练免疫相关的基因的染色质可及性增加
此外，研究团队通过分析人非小细胞肺癌患者肿瘤组织单细胞测序数据发现，人类肺癌组织中也存在具有训练免疫特征的AM，且与肿瘤微环境中的免疫激活相关。这意味着在模式小鼠体内发现的机制，在人体内可能也存在。

案例二一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换

期刊以及IF：Nature Cell Biology；21.3
合作单位：浙江大学生命科学研究院祝赛勇教授团队
研究材料：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、小鼠背侧成纤维细胞（MDF）、小鼠肺成纤维细胞（MLF）以及iPSC细胞
测序产品：CUT&Tag、ATAC-seq、RRBS、scRNA-seq、RNA-seq
结论：通过大规模的化学分子筛选，建立了快速化学重编程系统（FCR），其快速的动力学和高效率大大加快了细胞重编程的过程，为细胞重编程全面特征和分子机制提供了独特见解。

一、研究思路

二、研究结论

2.1 确定关键分子，构建高效快速的FCR系统

研究人员利用大规模的化学筛选方法确定了一系列有效分子，通过调整有效小分子的浓度和处理时间，建立了快速化学重编程（FCR）系统。其中，关键多能性基因Oct4在重编程第7天就已经被激活，进一步说明了FCR的快速性。通过细胞、分子和功能实验证明经过12天FCR产生的iPSC细胞在形态、分子和功能上与小鼠胚胎干细胞相似，表明FCR平台成功重编程。
2.2 ATAC-seq预测胚外内胚层相关的TFs

间充质向上皮转化(MET)和胚外内胚层(XEN)状态已被证明是CR过程中的关键状态。研究人员发现FCR与转录因子重编程（TFR）都会经历这两种状态，但在重编程路径上有明显差别，ATAC-seq组学预测胚外内胚层相关的TFs(Sox17、Gata4、Gata6和Foxa2)导致了两个重编程体系的路径差异。
2.3 RNA-seq显示FCR会经历一个独特的滞育类状态

选取了8个关键时间点的样本：0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、产生的iPSC cell。研究人员对比不同时间点不同重编程系统的转录组数据发现：FCR后期显著下调了核糖体、剪切体、DNA复制相关基因，但在TFR过程中并无此现象。这一结果揭示了FCR重编程后期会经历一个独特的滞育类状态。
2.4 滞育类状态是FCR过程中一个重要的中间态

考虑到细胞异质性，研究人员选取5个时间点样本：0天、4天、8天、12天、iPSC cell进行scRNA-seq分析，FCR依次会经历成纤维细胞、上皮样细胞、中间态细胞、新生iPSC和iPSC阶段，且scRNA-seq功能通路数据与RNA-seq结果一致，滞育相关基因在FCR后期细胞呈现明显下调。敲低促进细胞进入滞育状态的关键基因Larp1、Slc17a5、Prkaa1发现抑制滞育类状态会导致FCR效率降低，说明滞育类状态是FCR过程中一个重要的中间态。
2.5 ATAC+CUT&Tag证明H3K9me3通过抑制iPSC相关的ERVs影响FCR进程
选取了8个关键时间点的样本：0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、产生的iPSC cell，通过ATAC-seq & CUT&Tag多组学分析显示：染色质可及性区域大部分在FCR过程中呈现高度动态，即使在FCR后期的滞育类状态，且伴随着不同组蛋白修饰的动态变化。 H3K9me3作为异染色质区域的标志性沉默修饰，此前多次被证实在干细胞中可以调控ERVs。而在FCR过程中，ERVs的表达模式也呈现从MEF向iPSC的动态变化，说明了ERVs可能也会参与并影响重编程过程。该研究筛选了24个受H3K9me3调控的iPSC相关的ERVs（经典Oct4-Sox2-Tcf-Nanog TF基序）。敲低和小分子抑制实验证明H3K9me3甲基转移酶的抑制可以促进FCR进程；而敲低iPSC相关ERVs相关靶蛋白会导致FCR效率降低。这些结果说明H3K9me3通过抑制iPSC相关的ERVs从而作为FCR的障碍。

参考文献

[1] Wang T, Zhang J, Wang Y, et al. Influenza-trained mucosal-resident alveolar macrophages confer long-term antitumor immunity in the lungs[J]. Nature Immunology, 2023, 24(3): 423–438.

[2] Chen X, Lu Y, Wang L, et al. A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state[J]. Nature Cell Biology, 2023, 25(8): 1146–1156.

案例一、流感训练的粘膜常驻肺泡巨噬细胞在肺部具有长期的抗肿瘤免疫功能

案例二 一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换

案例二一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换