1. 质谱流式样本制备流程

2. 寄送样本类型

3. 寄送样本要求

• 3.1 新鲜组织样本

  1)在4h内使用PBS对获得的组织（黄豆粒大小以上，直径4-5mm）进行清洗，将血液残留洗净（冰上操作），若为肠道组织需清除肠内容物；然后将样本转移至装有预冷组织保存液的离心管中，样本必须完全被组织保存液浸没，将离心管用封口膜封好，避免气泡，防止与空气长时间接触。整个操作过程尽量无菌操作。
  （一般1ml组织保存液即可浸没，需选用合适大小的离心管，防止运输中样本与空气接触）
  注：内源酶含量高的功能脏器容易降解（例如：胰腺?脾脏、肠道、肺），建议客户尽可能多收集样本。
  2)如样本量足够建议首次寄送时同一样本2-3管重复，以防万一。
  3)客户需标明：样本名称，组织类型，离体时间，浸入组织保存液时间。
  4)寄送时装有样本的储存管不能和冰袋直接接触，需用泡沫包裹，保证 4℃左右的低温环境。
  5)冰袋寄送（注意不要选择干冰），务必保证在48小时内到达天津实验室。（若普通物流无法48h内到达，客户可选择冷链运输）
  6)为了提前确定合适的实验条件，送样时建议备注样本类型，例如：肿瘤，炎症，xx条件造模组等。 特殊样本注意事项：
  胰腺：胰腺癌组织属于普通样本，?癌旁（正常）组织属于困难样本（正常胰腺中有大量的RNA酶，使用抑制剂效果也有限，一般建议是离体后立刻放入保存液，并在6小时内处理完毕）
  骨：软骨属于普通样本，硬骨、椎间盘等钙化程度高的骨类样本，因活细胞占比低，属于困难样本
  血管：属于正常样本，但细胞得率较低，对样本量有较大要求，需要正常样本的三倍，约0.6g-1g，花生粒大小，尽量多送
  脑脊液：属于简单样本，但经常性会出现细胞量过少的情况，主要原因为正常的脑脊液中细胞本身含量少 组织保存液原理及储存：（推荐：美天旎MACS?组织保存液? 货号：130-100-008）
  组织保存液中含有低温状态下稳定细胞状态的关键离子以及pH缓冲液、能量代谢底物、自由基清除剂、渗透/吸胀稳定剂。
  储存条件：2~8℃ 避光保存，切勿冻存

• 3.2 新鲜细胞悬液(推荐<2h)

  1)全血样本：推荐用肝素或者柠檬酸盐做为抗凝剂，EDTA抗凝的PBMCs样本后续需要额外的洗涤步骤。一般情况下，推荐在2小时内将全血样本需要送达实验室，常温运输（22摄氏度最佳，不要低于15度或者高于35度）
  2)原代细胞：使用50mL离心管，注满培养基后常温运输。

• 3.3 细胞培养物

  1）镜检细胞状态良好，生长密度达 80%
  2）悬浮培养细胞、使用胰酶消化的贴壁细胞单细胞悬液离心（300-500g，5 分钟，4℃），去上清，依照下文中的“顺铂标记及细胞固定”方法进行后续处理
  3）若需公司进行标记固定操作，则需梯度冻存细胞，按照 2×10⁶ ~1×10⁷/mL 将细胞用冻存液重悬混匀（细胞冻存液：90%FBS+10%DMSO 现配现用或市售细胞冻存液），分装至冻存管中(细胞冻存请使用专用的细胞冻存管），每个冻存管不少于 500μL 细胞悬液。
  4）短期可储存于-80℃冰箱（1月内），长期保存置于液氮罐，寄送全程用干冰运输，干冰量需充足。

• 3.4 全血分离的的PBMCs

  推荐使用肝素、柠檬酸钠抗凝管，在离体4h内使用Ficoll或者Percol对全血进行密度梯度离心分离出PBMCs。
  1）用生理盐水/PBS将全血样本1：1稀释；
  2）在15mL离心管中加入1倍体积的Ficoll淋巴细胞分离液；将离心管倾斜，用一次性吸管缓缓的将稀释后的全血加入Ficoll上，注意不要晃动，以免扰动液面影响分层；
  3）常温400g，离心20min；
  4）吸出中层白色的PBMCs细胞，尽量不要吸到上层的血浆，转移至新的15ml离心管中。
  5）加入预热的无血清DMEM/1640，室温下300g，5 min离心细胞悬液。
  6）用移液器小心吸去上清。
  7）如果红细胞太多，需用红细胞裂解液处理样本。
  8）估计细胞数量，用1ml预热的无血清的DMEM/1640重悬细胞沉淀。依照下文中的“顺铂标记及细胞固定”方法进行后续处理。
  9）若需公司进行标记固定操作，则需梯度冻存细胞，重悬细胞后离心（300-500g，5分钟，4℃），去上清，按照2×10⁶ ~1×10⁷/mL将细胞用冻存液重悬混匀（细胞冻存液：90%FBS+10%DMSO 现配现用或市售细胞冻存液），分装至冻存管中(细胞冻存请使用专用的细胞冻存管），每个冻存管不少于 500μL 细胞悬液。
  10）短期可储存于-80℃冰箱（1月内），长期保存置于液氮罐，寄送全程用干冰运输，干冰量需充足。
  注意：血清或其他蛋白成分会影响顺铂染色，请用不含血清的培养基；如果需要进行细胞刺激，请将培养基预热。

• 细胞梯度冻存操作

  方法一：细胞程序冻存盒（推荐异丙醇冻存盒）
      1）将冻存盒恢复至室温
      2）用配置好的细胞冻存液重悬细胞后分装到冻存管中，拧好管盖，封口膜封管，做好标记
      3）冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱
      4）24h后冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存
  方法二：手动梯度降温
      1）用配置好的细胞冻存液重悬细胞后分装到冻存管中，拧好管盖，封口膜封管，做好标记
      2）冻存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的顺序放置

4. 顺铂标记及细胞固定操作

• 4.1 试剂准备

  名称	储存条件	备注
  顺铂(Cisplatin)	-20℃	公司邮寄，每管5ul浓度5mM稀释5000倍使用（稀释后工作液浓度1uM每管可用于50个样本标记）
  FIX1	常温	Fludigm，货号 201065，可用 1.6%的多聚甲醛（PFA）代替
  细胞染色缓冲液 （Cell Staining Buffer）	4℃	Fludigm， 货号 201068，可用含有 5% FBS 的 PBS 代替
  细胞冻存液（固定后）	现配现用	10%DMSO+90%细胞染色缓冲液（Cell Staining Buffer）
  PBS	常温

  注：
  1）固定后使用的细胞冻存液为10%DMSO+90%细胞染色缓冲液，区别于活细胞冻存液。细胞染色缓冲液用于后续细胞表面染色和清洗步骤，可减少抗体对目的细胞的非特异性结合。
  2）配制顺铂工作液及顺铂染色操作，务必佩戴手套。

• 4.2 顺铂染色

  1、取处理得到的新鲜单细胞悬液，1-3×10⁶ 细胞加入 1 mL PBS 重悬，300 g、5 min 离心去上清
  2、加入500ul顺铂工作液至细胞悬液中，充分混匀
  3、室温下孵育 2 min
  4、取出细胞悬液，加入1.5ml常温的 Cell Staining Buffer，混匀中止标记反应
  5、常温 300g离心 5 min
  6、加入 1mL 常温的 Cell Staining Buffer 重悬细胞
  附：顺铂染色原理: 短时间的处理过程中，顺铂无法进入活细胞内部，因此信号很弱。死细胞内大量蛋白与顺铂共价结合，会呈现较强的信号。以此来区分死活细胞。

• 4.3 细胞固定及冻存

  1、顺铂染色步骤结束后，加入500ul Fix1（需要稀释到 1×）混匀（或1.6%的多聚甲醛），立即用移液器上下吹打，并涡旋振荡混匀，以减少细胞形成二聚体，室温下孵育 10 min
  2、加入2ml Cell Staining Buffer , 混匀取少量细胞进行计数
  3、4℃，600 g，离心 5 min，吸弃上清
  4、根据计数结果调整冻存液体积，密度调至2×10⁶ ~1×10⁷/mL，将细胞用冻存液重悬混匀（细胞冻存液（固定后）：现配现用 10%DMSO+90%细胞染色缓冲液）
  5、将样品保存到-80℃冰箱，24h后转移至液氮罐中。