CUT&Tag-经典案例-不朽情缘

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CUT&Tag

案例一一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换

期刊以及IF：Nature Cell Biology；21.3
合作单位：浙江大学生命科学研究院祝赛勇教授团队
研究材料：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、小鼠背侧成纤维细胞（MDF）、小鼠肺成纤维细胞（MLF）以及iPSC细胞
测序产品：CUT&Tag、ATAC-seq、RRBS、scRNA-seq、RNA-seq
结论：通过大规模的化学分子筛选，建立了快速化学重编程系统（FCR），其快速的动力学和高效率大大加快了细胞重编程的过程，为细胞重编程全面特征和分子机制提供了独特见解。

一、研究思路

二、研究结论

2.1 确定关键分子，构建高效快速的FCR系统

研究人员利用大规模的化学筛选方法确定了一系列有效分子，通过调整有效小分子的浓度和处理时间，建立了快速化学重编程（FCR）系统。其中，关键多能性基因Oct4在重编程第7天就已经被激活，进一步说明了FCR的快速性。通过细胞、分子和功能实验证明经过12天FCR产生的iPSC细胞在形态、分子和功能上与小鼠胚胎干细胞相似，表明FCR平台成功重编程。
2.2 ATAC-seq预测胚外内胚层相关的TFs

间充质向上皮转化(MET)和胚外内胚层(XEN)状态已被证明是CR过程中的关键状态。研究人员发现FCR与转录因子重编程（TFR）都会经历这两种状态，但在重编程路径上有明显差别，ATAC-seq组学预测胚外内胚层相关的TFs(Sox17、Gata4、Gata6和Foxa2)导致了两个重编程体系的路径差异。
2.3 RNA-seq显示FCR会经历一个独特的滞育类状态

选取了8个关键时间点的样本：0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、产生的iPSC cell。研究人员对比不同时间点不同重编程系统的转录组数据发现：FCR后期显著下调了核糖体、剪切体、DNA复制相关基因，但在TFR过程中并无此现象。这一结果揭示了FCR重编程后期会经历一个独特的滞育类状态。
2.4 滞育类状态是FCR过程中一个重要的中间态

考虑到细胞异质性，研究人员选取5个时间点样本：0天、4天、8天、12天、iPSC cell进行scRNA-seq分析，FCR依次会经历成纤维细胞、上皮样细胞、中间态细胞、新生iPSC和iPSC阶段，且scRNA-seq功能通路数据与RNA-seq结果一致，滞育相关基因在FCR后期细胞呈现明显下调。敲低促进细胞进入滞育状态的关键基因Larp1、Slc17a5、Prkaa1发现抑制滞育类状态会导致FCR效率降低，说明滞育类状态是FCR过程中一个重要的中间态。
2.5 ATAC+CUT&Tag证明H3K9me3通过抑制iPSC相关的ERVs影响FCR进程
选取了8个关键时间点的样本：0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、产生的iPSC cell，通过ATAC-seq & CUT&Tag多组学分析显示：染色质可及性区域大部分在FCR过程中呈现高度动态，即使在FCR后期的滞育类状态，且伴随着不同组蛋白修饰的动态变化。 H3K9me3作为异染色质区域的标志性沉默修饰，此前多次被证实在干细胞中可以调控ERVs。而在FCR过程中，ERVs的表达模式也呈现从MEF向iPSC的动态变化，说明了ERVs可能也会参与并影响重编程过程。该研究筛选了24个受H3K9me3调控的iPSC相关的ERVs（经典Oct4-Sox2-Tcf-Nanog TF基序）。敲低和小分子抑制实验证明H3K9me3甲基转移酶的抑制可以促进FCR进程；而敲低iPSC相关ERVs相关靶蛋白会导致FCR效率降低。这些结果说明H3K9me3通过抑制iPSC相关的ERVs从而作为FCR的障碍。

案例二 CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells

期刊：Nature Communications
发表年份：2019年4月

一、研究背景

研究对比了CUT&Tag、CUT&RUN和ChIP-seq 三种方法检测DNA和蛋白互作位点的鉴定效果，包括H3K4甲基化在内的多种组蛋白修饰、RNA Pol II检测、转录因子结合靶点鉴定。

二、研究结果

1.相同测序深度下CUT＆Tag具有更低的背景噪声水平，而ChIP-seq需要更大的测序深度才能将染色质特征与背景区分开。
2.检测不同测序深度下峰的富集效率图，发现CUT＆Tag可以更快地填充低测序深度的峰，表明在相同测序深度下，CUT＆Tag检测的信号值更高，灵敏度更好。
3.分别对三种方法做了两次重复实验，并对实验结果进行分层聚类相关矩阵分析，证明了在本次实验中CUT＆Tag实验数据结果可重复性最好。

参考文献

[1] Chen X, Lu Y, Wang L, et al. A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state[J]. Nature Cell Biology, 2023, 25(8): 1146–1156.

[2] Hatice S, Kaya-Okur, Steven J, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): p. 1930.

案例一 一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换

案例二 CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells

案例一一种快速化学重编程系统通过类滞育状态促进细胞命运转换